《美國(guó)藥典》中的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法中規(guī)定,應(yīng)使用國(guó)家參考標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素(RSE),復(fù)溶后應(yīng)旋渦振蕩不少于20min;復(fù)溶后的原液于冰箱保存不超過(guò)14d,再次使用前要強(qiáng)烈地旋渦振蕩不少于5min;隨后的每一步稀釋前被稀釋液也要旋渦振蕩不少于1min;不能使用保存的稀釋液。美國(guó)鱟試劑廠家供應(yīng)的工作標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素(CSE)在使用說(shuō)明書(shū)中都對(duì)內(nèi)毒素的復(fù)溶和稀釋有使用旋渦混合器震蕩的要求。同樣,世界衛(wèi)生組織及各國(guó)藥典中的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法也對(duì)標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的稀釋有震蕩混合的要求。
為什么對(duì)標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的稀釋有如此特殊的要求呢?這與內(nèi)毒素的化學(xué)成分與結(jié)構(gòu)有關(guān)。
LPS是具有疏水和親水雙重活性的兩性分子;多糖鏈具有親水性;脂肪鏈具有疏水性。內(nèi)毒素溶于水或稀釋時(shí),LPS的親水性糖鏈朝向水和水接觸,而疏水性的脂質(zhì)鏈部分卻背向水,這樣,LPS的疏水端自然聚集成團(tuán),形成直徑約為0.1μm的雙層殼狀或泡囊。脂質(zhì)A藏于聚集團(tuán)的內(nèi)部或貼附于器皿上,而脂質(zhì)A是激活堂試劑的主要部分,在水溶液中,由于其疏水性而不能與鱟試劑充分接觸,造成檢測(cè)到的內(nèi)毒素含量偏低。若是檢測(cè)前利用旋渦裝置充分振蕩,可以使貼附于器皿上的內(nèi)毒素分子脫落,使聚集團(tuán)的相對(duì)分子質(zhì)量下降。經(jīng)振蕩后的內(nèi)毒素溶液重新靜置一段時(shí)間后,內(nèi)毒素仍然會(huì)聚集成團(tuán)或貼附于器皿壁上,所以樣品存放一段時(shí)間后,在使用前仍需充分振蕩。
實(shí)驗(yàn)表明,同一批號(hào)的國(guó)家參考標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素在稀釋時(shí)震蕩與否結(jié)果相差很大。若采用旋渦震蕩法稀釋內(nèi)毒素,效價(jià)測(cè)定的結(jié)果與國(guó)際參考標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素(IS)基本一致;若不經(jīng)振蕩稀釋?zhuān)瑒t測(cè)定的效價(jià)要比國(guó)際參考標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素低50%~75%。所以,內(nèi)毒素在稀釋時(shí)一定要充分振蕩,才能得到所標(biāo)示的效價(jià)。在實(shí)施1995年版的《中國(guó)藥典》前,我國(guó)相當(dāng)部分的鱟試劑在標(biāo)定靈敏度時(shí),沒(méi)采用振蕩稀釋內(nèi)毒素的方法,導(dǎo)致標(biāo)定的靈敏度高于實(shí)際值100%~300%。也就是說(shuō),鱟試劑用戶(hù)在使用比標(biāo)示靈敏度高1~3倍的堂試劑做細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。